通过介质灌装技术确认无菌保证水平

对于无菌加工的医疗产品（包括医疗器械、药品、生物制品和诊断用品），ISO13408-1《医疗保健产品的无菌加工第1部分：通用要求》是一项重要的GMP国际标准。该标准中规定的介质灌装（又称“过程模拟试验”）及相应的无菌控制技术具有先进性和科学性，非常值得参考。

该标准中涉及的无菌加工适用于以下两种情形：溶液的无菌制备和灌装；不能在其容器内进行最终灭菌的固体产品的无菌处理、传输和包装。ISO13408-1包括了用于无菌加工医疗保健产品的无菌保证水平的确认和控制过程、程序和规程的通用要求和指南。该国际标准对质量管理体系，人员，设施设计，无菌加工区、外部辅助区、环境空气系统及其控制，更衣区、无菌加工区的清洁和消毒，传递至无菌区的材料和设备，加工时间，环境监视程序，警戒线和措施线，调查及报告，介质灌装，成品无菌检验，在线蒸汽灭菌，冻干等方面提出了GMP要求。

关于介质灌装

典型的无菌加工生产模式是在无菌状态下，将产品分装于事先灭菌的容器内并在相同条件下封口。尽管产品是在净化条件下生产，在灌装过程中，附着在尘埃上的微生物仍会以较小的概率进入到产品中。

无菌加工技术不像最终灭菌技术那样能够提供0.0001%的无菌保证水平（即在每百万个单位产品中，有存活菌的产品数不超过一件），ISO13408-1所规定的无菌控制技术能提供0.1%的无菌保证水平。尽管如此，同其他最终灭菌的医疗产品一样，这类产品也不能简单地采用无菌检验来控制产品出厂，因为至少需要检验上千个产品才能证明每千个单位产品中是否少于1个染菌产品，这在实际中是做不到的。因此，应对无菌加工过程的无菌保证能力进行确认。

ISO13408-1设计了一种被称之为“介质灌装”的技术，其被用于确认一个无菌灌装线的无菌保证水平。该项技术是在尽量模拟实际生产的情况下，向大量（依据产品批量大小而定）的产品单元包装容器内灌装营养介质（如营养肉汤）并封口，用细菌培养技术对其进行培养，检验其中被染菌的单元数，再利用统计学方法推断该生产加工条件的无菌保证水平是否低于0.1%。对于被检查出的染菌容器，可根据其顺序编号和记录的灌装时间，进一步查找污染原因并加以消除。对无菌加工系统进行的这一形成文件的过程，在ISO13408-1中被称之为过程的“性能鉴定”。

两种应用情形

ISO13408-1对无菌加工的性能鉴定划分出了两种介质灌装情形，即首次性能鉴定（在新产品投产、新的灌装线启用之前；工艺和设备有较大改变、停产超过一年重新启用；超过措施线）和周期性重新鉴定（当产品的包装容器的构型改变时、生产线运行达到6个月时、或停用间隔超过6个月时）。前者是对生产系统缺乏了解的情况下所使用的一种验证模式，其规定的运行次数和介质灌装单元总数要比后者多，因此其对生产过程无菌保证水平的评价能力要优于后者，但其耗时多、费用高。而后者则是在系统已经通过了前一种验证的基础上对其进行重新确认的验证模式。因此，当首次对灌装线进行性能鉴定的结果没有出来之前，不能进行产品生产，而当对灌装线进行周期性性能鉴定的结果没有出来之前，可以先开始产品生产,但在获得可接受的介质灌装数据之前，产品不能放行（出厂）。

设计的代表性

介质灌装的设计宜尽可能模拟实际无菌生产过程，并包括产品加工中的“最坏状态”。因此，其设计应具有以下几方面的代表性：时间代表性，应选择正常工作阶段的不同的时间间隔,且在数日内进行介质灌装。操作代表性，应根据灌装线的自动化程度和生产中操作人员的干预程度来设计介质灌装的人员干预。企业应列出可能会在无菌加工过程中发生的、允许和禁止的干预事件的一览表。运行代表性，应在包括“最差情况”的加工条件（如：最大允许干预次数、生产线停机的纠正、灌装针/管的修理和更换、在线过滤器的更换以及所用人员的数量等）下进行介质灌装。介质灌装应持续足够长的时间，以包括实际加工中最常发生的操作。包装容器代表性，对于适用于多规格、多构型容器的灌装生产线，宜选用最大敞口直径的容器和最低生产线速度，这样可代表最差情况。但是，有时也将小型容器用来代表最差情况，这是由于小型容器在线运行中缺乏稳定性和更多地需要人工干预。

介质选择、培养和检查

同其他无菌检验技术一样，介质灌装中所用介质应是符合药典要求的对各种细菌都有促生长作用的介质，因此，应对选用介质的促生长性进行验证。

对于介质灌装单元的培养和检查有以下具体要求：介质培养之前，应去除泄漏或损坏的介质灌装评价单元，并对此去除过程进行记录。对介质灌装的评价单元应至少培养14天（在培养的早期阶段对各单元进行检查，有助于获得初步的结果）。培养温度应适于无菌灌装区域内预期微生物的生长要求。在介质灌装单元的贮存或处置过程中，应使介质与单元内的所有产品表面相接触。培养阶段全部完成后，目测检查介质灌装容器内是否存在微生物生长，并对被污染单元内存在的微生物种类进行识别，以便确定污染的可能来源（对介质灌装单元宜在批中按顺序进行识别，这样有助于识别一个受污染单元被灌装的时间，以便查找污染源）。

培养结果的接受准则

ISO13408-1对于介质灌装的结果是否可以接受给出了两个界限：一个为警戒线，一个为措施线。例如当单一介质灌装试验的单元数量为14440时，一次介质灌装运行中污染单元的数量警戒线为3，措施线为9。当介质灌装培养后的污染单元数超过警戒线时，表明生产线的污染率超过了0.05%，即说明污染率还没达到但已接近了0.1%的无菌保证水平，对此应予以警惕（故称之为“警戒线”）。而当培养后的污染单元数超过措施线时，表明生产线的污染率超过了0.1%，说明已不能满足0.1%的无菌保证水平，此时需要对污染原因进行调查，并采取必要的纠正措施（故称之为“措施线”）。根据ISO13408-1的设计，以上两个结论的置信水平均为95%。

ISO13408-1强调，不管介质灌装培养中阳性数量（染菌数）有多少，生产企业都应调查微生物污染的来源，从而确保生产环境和产品均无被污染的风险。

另外，介质灌装技术的应用依赖于经过良好培训的人员、确定的规程以及设计合理的设备和设施，并在环境监视和人员监视符合要求的基础上进行。