云南省4种伊蚊的乙型脑炎病毒分离物的研究
张海林 施华芳 米竹青 自登云 龚正达
侯宗柳 李兆祥 张云智 张嘉玉 杨兰萍
摘 要 在云南省西南边境9县市捕获伊蚊属雌性成蚊16种19367只，用细胞法和乳鼠法分离病毒。从185批6491只白纹伊蚊中分离到病毒2株，从50批1605只剌扰伊蚊中分离到病毒2株，从23批772只窄翅伊蚊中分离到病毒2株，从4批103只阿萨姆伊蚊中分离到病毒1株。其它12种共10396只伊蚊的病毒分离物为阴性。分离到的7株病毒经免疫荧光、酶免疫、血凝抑制和中和试验鉴定，均为乙型脑炎病毒(JE virus)。白纹伊蚊是野外竹林的优势蚊种。分析认为白纹伊蚊在当地乙型脑炎病毒保存和传播中起重要作用，刺扰伊蚊、窄翅伊蚊和阿萨姆伊蚊亦可参与该病毒的传播。
Isolation of Japanese Encephalitis Virus from Four Species of
Aedes Mosquito in Yunnan Province
Zhang Hailin Shi Huafang Mi Zhuqing Zi Dengyun Gong Zhengda
(Yunnan Provincial Institute of Epidemic Diseases Control and Research,Dali,Yunnan671000)
Abstract A total of19367adult female mosquitoes belonging to16species of Aedes genus were captured from nine countries,south-western part of Yunnan Province,China,and were examined by C6/36cell method and suckling mouse method.Two strains of Japanese encephalitis(JE)virus were isolated from6491(185pools)Aedes albopictus，two strains of JE virus were isolated from1605(50pools)Ae.vexans,two strains of JE virus were isolated from772(23pools)Ae.lineatopennis,and a strain of JE virus was isolated from103(4pools)Ae.assamensis.Isolation of JE virus was negative to other12species of Aedes mosquitoes.Ae.albopictus was the superior species of mosquitoes in bamboo forest.These results indicated that Ae.albopictus from Yunnan has a potential role in the maintenance and transmission of JE virus in nature.Ae.vexans,Ae.lineatopennis and Ae.assamensis are also considered to be transmitting vector of JE virus in Yunnan.
Key words Mosquito,Aedes,Japanese encephalitis virus,Vector,Yunnan province
国内外在流行性乙型脑炎(简称乙脑)媒介研究中做了大量工作，明确了三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)是本病主要传播媒介，一些库蚊属蚊虫在乙脑病毒传播中亦起重要作用。然而，伊蚊在本病传播中的作用研究较少。为了解伊蚊属蚊虫自然感染乙脑病毒情况及媒介意义，我们在云南省西南部热带地区采集蚊虫进行病毒分离，现将结果报告如下。
1材料与方法
1.1蚊虫采集 在云南省景洪、勐腊、勐海、河口、孟连、耿马、盈江、潞西和瑞丽9县市的野外竹林和畜圈捕蚊，将蚊虫置低温冻死后分类编号，20～50只一批，放入小瓶内，液氮冻存待检。
1.2病毒分离 蚊虫经常规处理后，制成接种液，接种于C6/36细胞和乳鼠分离病毒。细胞出现规律病变或乳鼠发病即行鉴定。
1.3病毒鉴定
1.3.1抗体 乙脑病毒家兔免疫血清为本室自制；乙脑病毒单克隆抗体是中国预防医学科学院病毒学研究所和中国药品生物制品检定所的制品；兔抗鼠荧光抗体和羊抗兔荧光抗体是北京生物制品研究所和兰州生物制品研究所的制品；酶标SpA是中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所的制品。
1.3.2抗原 乙脑病毒抗原为鼠脑蔗糖丙酮法抗原，本室制备。
1.3.3免疫荧光试验(IFAT)采用间接法。感染细胞培养至第5天，将细胞吹下，滴于玻片，常规染色制片，用OLYMPUS荧光显微镜检查。
1.3.4细胞酶免疫(C-EIA)试验 感染细胞培养于聚苯乙烯塑料板，至第5天，常规固定，加各种结合物及样品，用目测法判定结果。方法详见文献[1]。
1.3.5血凝(HA)及血凝抑制(HI)试验 采用常规微量法。用0.5%鸽血球测定。血清用白陶土和鸽血球常规处理，抗原为4u。以50%的血球凝集被抑制为终点。
1.3.6中和试验 采用固定血清稀释病毒法。用3～4周龄小白鼠测定，观察14d，按Reed-Muench法计算中和指数。
2结果
2.1病毒分离
在上述9县市共采获伊蚊属雌性成蚊16种19367只作病毒分离，从白纹伊蚊、剌扰伊蚊、窄翅伊蚊和阿萨姆伊蚊中分离出病毒7株(表1)。所获毒株均能引起乳小白鼠或3周龄小白鼠发病和死亡，亦能导致C6/36细胞出现病变，并具有滤过性。
表1从云南省4种伊蚊中分离乙脑病毒
Table1Isolation of Japanese encephalitis virus from four species of Aedes mosquitoes collected in Yunnan province
蚊种
Species of mosq.采集地点
Collecting site 蚊虫只数
No.of mosq.批数
Pools of mosq.阳性批数
No.of positive pools 病毒号及阳性蚊采集县
Virus code and collecting counties of positive mosq.
白纹伊蚊
Aedes albopictus 竹林Bamboo forest64911852B88-81景洪Jinghong
D266瑞丽Ruili
剌扰伊蚊
Aedes vexans 竹林Bamboo forest
畜圈Stable1194
41138
122
0B24-5景洪Jinghong
B86-17景洪Jinghong
窄翅伊蚊
Aedes lineatopennis 竹林Bamboo forest
畜圈Stable76
6963
201
1D107盈江Yingjiang
B88-17景洪Jinghong
阿萨姆伊蚊
Aedes assamensis 竹林Bamboo forest10341L99耿马Gengma
其它12种伊蚊(伪白纹伊蚊 Ae.pseudalbopictus、圆斑伊蚊 Ae.annandalei、台湾伊蚊 Ae.formosensis、显著伊蚊 Ae.prominens、股点伊蚊模拟亚种 Ae.gardnerii imitator、白雪伊蚊 Ae.niveus、白盏伊蚊 Ae.alboscutellatus、环胫伊蚊 Ae.desmotes、侧白伊蚊 Ae.albolateralis、白带伊蚊米基尔亚种 Ae.albotaeniatus mikiranus、爱氏伊蚊 Ae.eldridgei和亚白纹伊蚊 Ae.subalbopictus)共10396只蚊虫的病毒分离均为阴性。
2.2病毒鉴定
2.2.1免疫荧光试验 分离到的7株病毒均与乙脑单克隆抗体或乙脑免疫血清出现特异性荧光反应(表2)。
2.2.2细胞酶免疫试验 B88-81、B86-17、B88-21和L99株均与乙脑单克隆抗体或乙脑免疫血清产生特异性酶免疫反应(表2)。
2.2.3血凝特性 在pH6.4条件下，7株病毒的鼠脑蔗糖丙酮抗原均能与鸽血球出现凝集，滴度为1∶160～1∶5120之间(表2)。
2.2.4血凝抑制试验 所有分离株均能与乙脑病毒产生高滴度的抑制作用，抑制效价高达1∶320～1∶2560(表2)。
2.2.5中和试验 B88-81、B24-5、B86-17、B88-21和L99株对乙脑病毒的中和指数达到123～1000(表2)。
试验证实，分离到的7株病毒均为乙脑病毒。
表2分离自伊蚊的7株乙脑病毒的鉴定
Table2Identification of seven strains of Japanese encephalitis virus isolated from Aedes mosquitoes
毒株
Virus
strains C6/36细胞法
C6/36cell method 乳鼠法
Sucking mouse method
细胞病变
CPE 免疫荧光
JE McAb
IFAT 细胞酶免疫
JE McAb
C-EIA 乳鼠发病死亡
Illness and death
of mice tested 血凝
HA 乙脑血抑
JE HI 对乙脑中和指数
Neu.index
to JE virus
B88-81 ＋320640794
D266 ND ＋12801280ND
B24-5 ND ＋640320123
B86-17 ＋12806401000
B88-21 ＋6403201000
D107 ND ＋160640ND
L99 +51202560354
ND：未做(Not done)
2.34种伊蚊的分布特点
白纹伊蚊在本次调查的9县市均有分布，其活动生态环境主要在居民点附近竹林和山坡竹林，畜圈和人房内几乎不能捕到该蚊。白纹伊蚊在野外竹林区的构成比为30.46%(7429只/45种24387只)，属优势或较优势种。
剌扰伊蚊仅在景洪、勐腊、耿马和河口捕获，主要分布于野外竹林，在该生境的构成比为12.71%(1194只/17种9394只)；在畜圈也有分布，构成比为1.26%(428只/20种33929只)。
窄翅伊蚊在景洪、耿马、瑞丽和盈江的畜圈和野外竹林均有分布，畜圈的构成比为2.89%(696只/19种24060只)，野外竹林(耿马)的构成比为2.75%(76只/24种2760只)，其数量较少。
阿萨姆伊蚊仅在耿马和潞西的野外竹林捕到，构成比为2.21%(103只/24种4656只)，该蚊分布较为局限，且数量较少。
3讨论
白纹伊蚊在云南分布广泛，尤其在本省西南部热带和邻近热带的地区，是居民点附近竹林和山坡竹林区的主要蚊种之一。本次9个县市调查，该蚊为野外竹林区的优势或较优势蚊种。白纹伊蚊分布与人居有一定关系，凡该蚊多的生境，均为靠近村寨的竹林、树林。该蚊嗜血习性较广，并有多次吸血的特性。国外研究表明，白纹伊蚊能感染、传播和经卵传递乙脑病毒［2～5］。本次从云南自然界白纹伊蚊中分离到乙脑病毒，并证明云南该蚊对乙脑病毒有较高的易感性，还能叮咬传播和经卵传递乙脑病毒［6，7］。白纹伊蚊在乙脑流行中可与库蚊协同作用，是乙脑病毒重要媒介之一，在自然界乙脑病毒保存和传播中起重要作用。
以往未见从剌扰伊蚊、窄翅伊蚊和阿萨姆伊蚊中分离到乙脑病毒的报道。这次从这3种伊蚊中分得乙脑病毒，表明它们可参与乙脑病毒的传播。尤其是剌扰伊蚊和窄翅伊蚊，不仅分布于农村畜圈，在野外竹林也有分布，与人畜关系较为密切，具有重要的流行病学意义。
鉴于云南乙脑疫区分布较广，加之自然地理条件较特殊，蚊虫种类多，我们认为乙脑媒介亦较为复杂，有必要进行深入的研究。
* 云南省卫生厅科研基金资助课题
作者单位：云南省流行病防治研究所，云南大理671000
参考文献
[1]张海林，施华芳.C-ELISA与D-ELISA在乙脑和登革病毒快速检测上的应用.中国人兽共患病杂志，1988，4(2)：46～47
[2]Rosen L,Tesh R B,Lien J C et al.Transovarial transmission of Japanese encephalitis virus by mosquitoes.Science,1978,199(4331):909～911
[3]Rosen L,Roseboom L E,Gubler D J et alparative susceptibility of mosquito species and strains to oral and parenteral infection with dengue and Japanese encephalitis viruses.Am J Trop Med Hyg,1985,34(3):603～615
[4]Shroyer D A.Aedes albopictus and arboviruses:a concise review of the literature.J Am Mosq Control Assoc,1986,2(3):424～428
[5]Moore C G,Mitchell C J.Aedes albopictus in the United States:Ten-year presence and public health implications.Emerging Infectious Diseases,1997,3(3):329～334
[6]张海林，米竹青，张云智.云南白纹伊蚊感染、传播登革热和乙型脑炎病毒的研究.中国媒介生物学及控制杂志，1997，8(1)：50～53
[7]张海林，米竹青，张云智.白纹伊蚊垂直传播乙型脑炎病毒的研究.病毒学报，1996，12(1)：42～47
原作者：张海林 施华芳 米竹青 自登云 龚正达