中国医科院医药生技所建立三种新药筛选平台并确定相关产物结构

近年来，基于新作用靶点建立新的药物高通量筛选方法、模型的研究明显增多，中国医学科学院/中国协和医科大学（现更名为北京协和医学院）医药生物技术研究所在这方面取得卓有成效的进展：以表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶（TK）为靶点，设计建立了其抑制剂的高通量筛选模型；研究建立了以人骨形态形成蛋白因子Ⅱ（BMP-2）为作用靶点的抗骨质疏松药物筛选模型；建立了由土壤真菌筛选抗凝血因子Xa的快速高通量筛选方法等，并利用这些新的筛选方法、模型筛选到了若干阳性菌株，分离、鉴别了一批次级代谢产物的活性和结构，发现了有活性的抗肿瘤、抗骨质疏松以及心血管病作用等的化合物。

EGFR在多种上皮性肿瘤中存在过度表达，如非小细胞性肺癌、乳腺癌、头颈癌等。EGFR的表达与细胞恶变，肿瘤的增殖、转移和肿瘤血管形成相关。

首先，研究人员进行了具胞内信号传导功能的表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶的克隆表达及其抑制剂高通量筛选模型的构建研究。他们根据已知的EGFRcDNA序列设计编码了EGFR胞内酪氨酸激酶区的引物，并在引物的5’末端分别引入KpnI和HindIII限制性酶切位点,以人脐静脉内皮细胞总RNA为模板，通过RT-PCR获得编码EGFR胞内酪氨酸激酶的基因片段cDNA。将其插入大肠杆菌表达载体pET-30a，获得重组质粒pET-TK，将其转化至大肠杆菌BL21，测序结果与已知E-GFR基因编码序列比较完全一致。进一步研究结果表明,所表达的重组EGFR-TK主要以包涵体的形式存在。研究人员对包涵体重组蛋白进行复性，并采用组氨酸亲和层析柱纯化，同时对蛋白进行酶学性质的研究，终于构建成功酪氨酸激酶抑制剂的高通量筛选模型。

研究人员将进一步对化合物和微生物菌株进行筛选，以获得具有EGFR-TK抑制活性的化合物，为新的抗肿瘤药物研究奠定基础。

其次，该所微生物新药筛选重点实验室的研究人员，建立了以人骨形态形成蛋白因子Ⅱ（BMP-2）为作用靶点的抗骨质疏松药物筛选模型，并深入进行了诺卡菌属菌株04-5195的鉴别及所产生的BMP-2上调活性物质的研究。

骨质疏松的发生是由于破骨细胞和成骨细胞动态平衡被打破，骨溶解超过骨形成所致。以往的研究与治疗方案大多是针对破骨细胞以控制骨质的损失，但大量的临床病例证明，促进骨的形成是治疗骨质疏松症的根本措施所在，也就是通过改善骨质的形成代谢，增强成骨细胞作用，最终达到恢复患者正常骨水平的目的。

成骨细胞的产生、增殖、分化受多种因素的调节，其中BMP-2在成骨细胞的分化过程中起非常重要的作用。研究人员建立了以人bmp-2启动子为作用靶点的促BMP－2上调的抗骨质疏松药物筛选新模型，以荧光素酶的表达量作为样品促bmp-2基因表达的检测指标。并应用该模型筛选了5000多个微生物发酵粗品和500个合成化合物，从中获得若干阳性发酵样品和化合物。

其中，菌株04-5195是从我国济南四方塔采集的土样中分离得到的一株放线菌。研究人员对其进行多相分类研究并与已知相关菌株比较，发现该菌株具有典型的诺卡菌属菌种的形态学特征；对其表型和基因型进行综合分析，表明该菌株为诺卡菌属的一个新种，将它定名为济南诺卡氏菌新种(Nocardia jinanensis sp.nov.)。进一步对该菌株进行扩大发酵，发酵滤液用型号为7.5×60厘米的X-5大孔树脂柱粗提取，50％和80％丙酮洗脱，分部收集并测定生物活性。活性部分合并浓缩后，经型号为3.5×30厘米硅胶柱分离，收集活性成分并经ODS柱多次纯化，直至得单一活性组分。研究发现，此单一活性组分为非Statin类化合物，最大紫外吸收波长在318纳米，具有高上调bmp-2启动子的活性。目前，研究人员正在对其结构进行解析。

此外，该所研究人员还与华北制药集团新药研发中心合作，建立了一个快速的高通量筛选方法，从大量土壤真菌代谢产物中筛选Xa因子抑制剂，并得到阳性菌株F03-766。

抗凝血药是一类干扰凝血因子、阻止血液凝固的药物，主要用于血栓栓塞性疾病的防治。凝血因子的级联活化是导致血液凝固的触发机制，其中因子X被激活为Xa是此过程的关键步骤。Xa因子只单纯促进凝血，没有凝血酶抑制剂的副作用，因而成为近年来抗凝血药物研究的热点之一。

研究人员建立了一种精确、快速的高通量的Xa因子抑制剂的体外筛选模型，从真菌次生代谢产物中筛选到一株阳性菌株F03-766。该菌株的发酵液经有机溶剂提取、硅胶柱色谱、ODS柱色谱、SephadexLH-20柱色谱及HPLC制备分离，得到4个活性化合物F03-766A、B、C、D，均对因子Xa有较强活性，其IC50分别是0.58微克/毫升、0.70微克/毫升、0.72微克/毫升、0.75微克/毫升。据悉，进一步的抗凝血评价工作正在进行之中。